对于在-80℃保存时间较久的甘油菌，有可能出现以下情况：（1）被杂菌污染；（2）目的菌质粒丢失；（3）目的菌活性变低。所以，需要通过平板划线、筛选培养，重新获得高活性的单个目的菌。
二、如何进行平板划线？
1、三区平板划线
将平板划分为三个逐渐缩小的区域，接种环依次密集到稀疏划线，并与前一区轻微搭接，通过逐级稀释在第三区获得单菌落，常用于临床标本的首次分离，尤其适合菌量不高的样品。
2、四区平板划线
在三区基础上增加一个区域，四个区域依次递减、轻微搭接，稀释效果更彻底，能进一步降低菌量密度，适合污染严重或菌量高的样品，提高纯培养的成功率。
3、单次连续之字划线
接种环从平板一端到另一端连续划“之”字，不交叉、不重复，使菌液沿全程均匀分布，适合菌量已知的纯培养或增菌液接种；也可用于混合样本分离，但稀释梯度不如分区划线明显，获得单菌落的概率相对较低。
4、网状平板划线
先做一次“之”字划线，再将平板旋转90°进行垂直划线，形成交叉网格，增加划线面积和稀释机会，适合生长缓慢或菌落细小的微生物分离，但交叉处菌落可能过密。
三、三区平板划线操作步骤
1、 左手拿培养皿，右手持接种环，打开盖子一条缝隙，将沾菌接种环在平皿边缘“之”字划第一区域（约 1/4～1/5 面积）。
2、 转动培养皿约 120°，灼烧冷却接种环，从第一区末端带菌在第二区划线。
3、 再转动培养皿约 120°，灼烧冷却接种环，从第二区末端带菌在第三区划线。
⚠️ 注意：各区划线仅与前一区少量相交，绝不与其他区域重叠；全程应在超净工作台中进行。
四、常见问题及解决办法
1、菌落连成一片（“草坪”）
原因：菌量过大或划线过密，稀释梯度不足。
解决：甘油菌先 10⁻⁴～10⁻⁵ 稀释；第二、三区再稀疏些；必要时改用四区法。
2、平板无菌落
原因：菌已失活或接种量过少；抗性平板选错抗生素；培养条件不符。
解决：换用新鲜甘油菌、降低抗生素浓度、检查培养温度/气体条件。
3、杂菌覆盖目的菌
原因：甘油菌污染或操作污染。
解决：重新划线时加入目的菌特需抗性/显色底物；操作前用75%酒精擦拭工作台并紫外再照15 min；必要时用无菌滤纸贴盖法二次纯化。
4、 单菌落过少或分布不均
原因：接种环未充分冷却杀死部分菌；旋转角度不足导致稀释梯度不足。
解决：灼烧后冷却 5–10 s；确保每区旋转≈120°；可在第三区尾端再轻划两条补充线。
